马铃薯块茎和土壤样品中粉痂病菌快速 检测方法的建立（二） 薯块速检ddH2O 作为阴性对照

1.4 引物特异性检测

引物 A5/A9、马铃C3/C8 对马铃薯粉痂菌基因组DNA及其他 11 个非靶标菌株基因组 DNA进行普通 PCR；引物 QF/QR 对马铃薯粉痂菌基因组 DNA 及其他 11 个非靶标菌株基因组DNA 进行荧光 PCR，薯块速检ddH2O 作为阴性对照，茎和痂病菌快建立检测引物的土壤特异性。普通 PCR 反应体系（50 μL）为：2×Taq PCR Master Mix 25 μL，样品上下游引物（0.1 μmol·μL^-1）各 0.5μL，中粉模板 DNA（10 ng·μL^-1）0.5 μL，测方ddH2O 23.5 μL。马铃

扩增条件为 94 ℃预变性5min，薯块速检94 ℃变性45s，茎和痂病菌快建立55℃退火30s，土壤72 ℃延伸45 ，样品35个循环；72℃补充延伸 10min。中粉荧光 PCR 反应体系（20 μL）为：2×SuperReal PreMix Plus 10μL，测方上下游引物（0.1 μmol·μL^-1）各 0.5 μL，马铃50×ROX Reference Dye 0.4 μL，模板 DNA（10 ng·μL^-1）0.5 μL，ddH2O 8.1 μL。荧光 PCR 反应条件为 95℃预变性 15 min，95℃变性 10 s，60℃退火 32 s，40 个循环。

1.5 重组质粒的制备

马铃薯粉痂菌特异性引物 QF/QR 的扩增产物经回收纯化后，与 pEASY®-T1 载体于 25℃连接，转入大肠杆菌 Trans1-T1 感受态细胞中。吸取菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素的 LB固体平板上，37℃培养 24 h。挑取阳性克隆，转入含有氨苄青霉素的 LB 液体培养基中，37℃、180 r·min^-1振荡培养12 h后，提取重组质粒并进行PCR扩增，扩增产物送至北京博迈德生物公司测序，验证是否正确插入目的片段。用测定质粒 DNA 浓度和纯度，根据摩尔定律，计算单位体积质粒所含的 DNA 拷贝数浓度。质粒拷贝数=[质粒浓度（ng·μL^-1）×质粒体积（μL）×6.02×1023]/[（载体长度 bp+片段长度 bp）×660 g·mol^-1]

1.6 灵敏度检测使用

NanoDrop 2000 紫外分光光度计，测定马铃薯粉痂病菌质粒 DNA 浓度，再以 10倍梯度稀释，分别进行普通 PCR 和实时荧光定量 PCR 扩增，根据有无扩增条带及荧光信号值大小，检测其灵敏度。

1.7 标准曲线建立

将阳性重组质粒 DNA 进行 10 倍梯度稀释，使用引物 QF/QR 进行荧光定量 PCR 扩增。标准曲线的横坐标和纵坐标分别设定为质粒浓度对数值和循环阈值，使用 Excel 2010 软件构建马铃薯粉痂菌荧光定量 PCR 标准曲线。

1.8 田间土壤及罹病块茎组织样品检测及验证

分别从云南省邵通市、甘肃省定西市和河北省张家口市采集 18份带菌土壤和18 份带菌种薯样品，按照 1.2 中的方法提取植物组织样品总 DNA，进行普通 PCR 和荧光 PCR 检测，
计算检出率。

2 结果与分析

2.1 引物特异性验证

应用引物 A5/A9 和 C3/C8 对马铃薯粉痂病菌和其它 11 株非靶标病原真菌基因组 DNA进行常规 PCR 扩增，结果显示仅马铃薯粉痂病菌 DNA 扩增出 281 和 391 bp 的目的条带，而其它供试菌株 DNA 和清水对照未扩增出条带（图 2）。应用引物 QF/QR 进行实时荧光定量 PCR 扩增，结果表明该引物仅对马铃薯粉痂病菌有唯一的产物吸收峰（图 3）。

2.2 灵敏度检测

利用引物 QF/QR 对不同浓度质粒 DNA 进行常规 PCR 和荧光定量 PCR 扩增，结果表明常规 PCR 灵敏度为 1.38×104 fg·μL^-1，荧光定量 PCR 灵敏度为 13.8 fg·μL^-1，是常规 PCR检测灵敏度的 1000 倍（图 4）。

2.3 标准曲线的建立

以不同稀释浓度的质粒DNA为模板，利用引物 QF/QR 进行荧光定量 PCR 扩增，结果表明，荧光 PCR 熔解峰单峰，标准曲线为 y=-3.8939x+35.228，R2=0.9966，该体系线性关系良好（图 5）。

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